一、實驗目的和內容 

目的：學習培養厭氧微生物的方法，了解厭氧微生物生長的特性。 內容：1、深層穿刺法，厭氧培養丙酮丁醇梭菌。 

2、真空干燥器厭氧培養丙酮丁醇梭菌及產氣莢膜梭菌。 3、針筒厭氧法培養丙酮丁醇梭菌及產氣莢膜梭菌。 4、厭氧罐培養法示范。 

5、厭氧袋法培養丙酮丁醇梭菌。 二、實驗材料和用具 

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)。 RCM培養基（即強化梭菌培養基）、TYA培養基、玉米醪培養基、中性紅培養基、明膠麥芽汁培養基。CaCO3，焦性沒食子酸(即鄰苯三酚)、Na2CO3，10%NaOH溶液，0.5%美藍水溶液，6%葡萄糖水溶液，鈀粒(A型)，NaBH4，KBH4，NaHCO3，檸檬酸。 

帶塞或塑料帽玻璃管(直徑18~20mm，長180~200mm)，1mL血漿瓶，250mL血漿瓶，2OmL和50mL針簡，250mL三角瓶，試管，厭氧罐，厭氧袋(不透氣的無毒復合透明薄膜塑料袋，14cm×32cm)，培養皿，真空泵，帶活塞干燥器，氮氣鋼瓶。 三、操作步驟 

(一)真空干燥器厭氧培養法 

此法不適用于培養需要CO2的微生物。該法是在干燥器內使焦性沒食子酸與氫氧化鈉溶液發生反應而吸氧，形成無氧的小環境而使厭氧菌生長。 

1．培養基準備與接種  將3支裝有玉米醪培養基或RCM培養基的大試管放在水浴中煮沸l0min，以趕出其中溶解的氧氣，迅速冷卻后(切勿搖動)將其中2支試管分別接種丙酮丁醇梭菌和產氣莢膜梭菌。 2．干燥器準備與抽氣   在帶活塞的干燥器內底部，預先放入焦性沒食子酸粉末20g和斜放盛有200mL10% NaOH溶液的燒杯。將接種有厭氧菌的培養管放入干燥器內。在干燥器口上涂抹凡士林，密封后接通真空泵，抽氣3~5min，關閉活塞。輕輕搖動干燥器，促使燒杯中的NaOH溶液倒入焦性沒食子酸中，兩種物質混合發生吸氧反應，使干燥器中形成無氧小環境(圖18-lA) 3．觀察結果  將干燥器置于37℃恒溫箱中培養約7d，取出培養管，分別制片觀察菌體特征。 (二)深層穿刺厭氧培養法 

此法操作簡單，適用于一般厭氧微生物的活化和分離培養，但不能用于擴大培養。 

1．接種培養   將玻璃管一頭塞上橡膠塞，裝入培養基(RCM或TYA培養基)的高度為管長的2/3，套上塑料帽或橡皮塞，滅菌并凝固后，將丙酮丁醇梭菌用接種針穿刺接種(圖18—lB)，置37℃恒溫箱中培養6～7d。 

2．觀察結果   觀察菌落形態特征并制片于顯微鏡下觀察菌體的細胞形態，并記錄結果。 (三)針筒厭氧培養法 

此法適于活化厭氧菌和小體積的擴大培養。 1．培養基準備   將滅菌的裝有RCM或TYA培養基的血漿瓶放在沸水浴中加熱10min，在瓶口膠塞上插上2枚醫用針頭排氣，以趕出殘留在培養基內的氧氣。隨后將血漿瓶從沸水浴中取出，再用氮氣鋼瓶中的高純氮氣(99.99%)通過膠塞上的一枚針頭引人血漿瓶中，使血漿瓶內充滿氮氣，瓶內培養基在冷卻過程中保持無氧狀態。 2．針筒裝灌培養基   將滅菌的針筒接上針頭經膠塞刺人血漿瓶中，先利用瓶內氮氣的壓力將針筒的推桿慢慢推開，待吸入一定體積的氮氣后取下針筒，排盡針筒內的氣體。按此重復操作3次，以排盡針筒內的殘留空氣而維持無氧狀態。使血漿瓶口朝下傾斜，利用瓶內壓力將培養液緩慢注入針筒內，然后取下針筒，用經滅菌的帶孔橡皮塞迅速把針筒頭部塞住(圖18-2)。 

3．接種培養采用無菌操作以菌種液針筒將菌穿刺接入培養液針筒中(圖18-3)，置37℃恒溫培養，用于菌種活化可培養16~18h，用于測定菌體生長可培養6~7d。 4．觀察結果取菌制片觀察。 (四)厭氧罐培養法 

此法利用透明的聚碳酸酯硬質塑料制成的一種小型罐狀密封容器，采用抽氣換氣法充入氫氣，利用鈀作催化劑與罐內氧氣發生作用達到除氧的目的，同時充入10%(V/V)的CO2以促進某些革蘭氏陰性厭氧菌的生長(圖18-4)。 其實驗操作過程如下： 1．制備厭氧度指示劑  取3mL0.5%美藍水溶液用蒸餾水稀釋**100mL；6mL0.1mol/LNaOH溶液用蒸餾水稀釋**l00mL；6g葡萄糖加蒸餾水**l00mL。將上述3種溶液等體積混合，并用針筒注入安瓿管內lmL，沸水浴加熱**無色，立即封口即成。取一根直徑1cm、長8cm的無毒透明塑料軟管，將裝有美藍指示劑的安瓿管置于軟管中，制成美藍厭氧度指示管。 2．培養基準備與接種   將制成無菌無氧的RCM或TYA培養基平板，在無菌操作下迅速劃線接種丙酮丁醇梭菌或產氣莢膜梭菌，并立即將平皿倒置放入已準備好的厭氧罐中，同時放入一支美藍厭氧指示劑管。隨后及時旋緊罐蓋，達到完全密封。 

3．抽氣換氣   將真空泵接通厭氧罐抽氣接口(圖18-4)，抽真空**表指針0.09~0.093MPa(680~700mmHg柱)時，關閉抽氣口活塞，用止血鉗夾住抽氣橡皮管。打開氮氣鋼瓶氣閥向厭氧罐內充入氮氣，當真空表指針返回到零位終止充氮。再接上述步驟抽氣和充入氮氣，如此重復2~3次，使罐中氧的含量達**低度。**后充入的氮氣使真空表指針達0.02MPa(l60mmHg)時停止充氮氣。再開啟CO2鋼瓶閥門，向罐內充入CO2直**真空表指針達到0.011MPa(80mmHg)時停止。為除盡罐內殘留的氧，以氫氣袋(用醫用“氧氣袋”灌滿氫氣)氣管連接向厭氧罐內充入氫氣直**真空表指針回到零位為止。充氣完畢，封閉厭氧罐。 #p#分頁標題#e#

4．恒溫培養   將厭氧罐置于37℃恒溫箱中培養6~7d，注意罐中厭氧指示劑的顏色變化。 5．觀察結果和鏡檢   從罐內取出平皿，觀察菌落特征。并挑取菌落作涂片，用結晶紫染液染色，鏡檢，比較不同菌的菌體細胞形態特征，并作記錄。 (五)厭氧袋培養法 

厭氧袋除氧是利用氫硼化鈉與水反應產生氫，在催化劑鈀的作用下，氫與袋中氧結合生成水達到除氧目的，除氧效果可從袋中厭氧度指示劑觀察。同時，利用檸檬酸與碳酸氫鈉的作用產生CO2，以有利于需要CO2的厭氧菌的生長。 其反應過程為： 

1．厭氧袋   選用無毒復合透明薄膜塑料，采用塑膜封口機或電熱法燙制成20×40cm塑料袋。 

2．產氣管  取一根無毒塑料軟管(直徑2.0cm，長20cm)，管壁制成小孔，一端封實。天平稱取0.4g NaBH4和0.4g NaHCO3，用擦鏡紙包成小包，塞入軟管底部，其上基入3層擦鏡紙，將裝有5%檸檬酸溶液3mL的安瓿管塞入塑料管中，管口塞上有缺口的泡沫塑料小塞，即制成產氣管。 

3．厭氧度指示管  取一根無毒透明塑料軟管(直徑2cm，長10cm)。量取0.5%美藍水溶液3mL，用蒸餾水稀釋**100mL；取0.lmol/LNaOH溶液6mL，用蒸餾水稀釋**100mL；稱取6g葡萄糖加蒸餾水稀釋成100mL。將上述3種溶液等量混合后取2mL裝入安瓿管，經沸水浴加熱**無色后立即封口，即為厭氧度指示管。 

4．催化劑和吸濕劑   催化劑鈀粒(A型)10~20粒加熱活化，隨后裝入帶孔的小塑料硬管內，制成鈀粒催化管。取變色硅膠少許，用濾紙包好塞入帶孔塑料管內，為吸濕劑管。 

5．培養基準備和接種   將滅菌的中性紅培養基和CaCO3明膠培養基分別在沸水浴中煮沸10min，以趕出其中溶解的氧，冷卻**50C左右倒平板，冷凝后接種丙酮丁醇梭菌。隨后立即將平皿放入厭氧袋中，每袋可倒置平放3個平皿。 

6．封袋除氧和培養   將產氣管、厭氧度指示管、鈀粒催化劑管和吸濕劑管分別放入袋中平皿兩邊，盡量趕出袋中空氣，用寬透明膠帶將袋口封住，用一根lcm寬、與袋口寬等長的有機玻璃條或小木條將袋口卷折2~3層，用夾子夾緊，嚴防漏氣(圖18-5)。使袋口傾斜向上，隨后隔袋折斷產氣管中的安瓿管頸，使試劑反應產生H2和CO2，H2在鈀粒催化下與袋內O2化合生成水。經5~l0min左右，鈀粒催化管處升溫發熱，生成少量水蒸汽。在折斷產氣管半小時后，隔袋折斷厭氧度指示管中的安瓶管頸，觀察指示劑不變藍，表明袋內己形成厭氧環境。此時將厭氧袋轉入37℃恒溫箱中培養6~7d。 7．觀察結果和鏡檢   從袋中取出平皿觀察菌落特征。丙酮丁醇梭菌在中性紅平板上顯示黃色菌落，挑取典型單菌落涂片染色后進行鏡檢，觀察菌體細胞形態特征，并作記錄。 四、注意事項 

1．培養需要CO2的厭氧菌時，須在厭氧小環境中供應CO2。 

2．氫氣是危險易爆氣體，使用氫氣鋼瓶充氫時，應嚴格按操作規程進行，切勿大意，嚴防事故。 

3．選用干燥器、針筒、厭氧罐或厭氧袋時，應事先仔細檢查其密封性能，以防漏氣。 

4．已制備滅菌的培養基在接種前應在沸水浴中煮沸10min，以消除溶解在培養基中的氧氣。 5．針筒培養液刃天青指示劑出現紅色，表明有殘留氧氣。厭氧袋和厭氧罐中美藍厭氣度指示劑變成藍色，表明除氧不夠。 

6．產氣莢膜梭菌為條件致病菌，防止進入口中和沾上傷口。 五、演示 

1．顯示深層穿刺厭氧培養的厭氧菌菌落特征及生長情況。 

2．選用真空干燥器、針筒、厭氧罐或厭氧袋厭氧培養法，演示該方法的操作過程，特別是厭氧罐的抽氣換氣和厭氧袋的封袋除氧操作過程。 六、實驗報告 

1．實驗中選用厭氧培養法的培養結果：       

2．試比較以上厭氧培養方法的優缺點，并分析其成功的關鍵。 七、問題和思考 

1．請設計一個試驗方案，如何從土壤中分離、純化和培養出厭氧菌。 2．試舉例說明研究厭氧菌的實際意義。