對于厭氧細菌和古菌，在進行取樣、分離和培養的各個環節均必須注重這類微生物的特性，采用相適應的方法，使采集的樣品具有代表性，盡可能保持其在原生境的種類和數量，并通過分離和培養將其反映和顯示出來，同時取得所需的試驗菌種。
本規程規定了厭氧細菌和古菌樣品采集、分離、培養的方法和要求。 厭氧細菌和古菌樣品采集、分離、培養技術規程 1 范圍
本規程規定了厭氧細菌和古菌樣品采集的要求及根據樣品量的大小所應采取的采樣方法；規定了厭氧細菌、古菌樣品分離和培養的具體方法。
本規程適用于不同生境中厭氧細菌和古菌樣品的采集；以及各類厭氧細菌和古菌的分離培養。 2 術語和定義
本規范采用下列術語和定義。2.1 厭氧細菌和古菌 Anaerobic Bacteria and Archaea
厭氧細菌和古菌如梭菌屬（Clostridium）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）等，是指要求在沒有分子氧條件下才能生活的各種細菌和古菌。本文所指厭氧細菌和古菌為專性厭氧細菌和古菌， 2.2 Hungate厭氧技術 Hungate method
Hungate厭氧技術是美G微生物學家Hungate于1950年**的一套有效的用于厭氧菌分離和培養的技術，它包括培養基預還原和在無氧環境中進行的菌株分離和培養操作技術。利用該技術，許多嚴格厭氧細菌和古菌的分離、培養獲得了成功。
2.3 厭氧手套箱 Anaerobic chamber (glove box)
厭氧手套箱利用預置在箱內的鈀催化劑，催化氫氣與氧結合生成水，從而達到除去箱內氧氣的目的。它包括操作室和交換室兩部分。操作室用于厭氧分離、培養，交換室用于操作室內外物品的傳遞。 3 樣品采集
采集厭氧細菌和古菌樣品時，應盡可能避免將樣品較長時間暴露于空氣中,盡快將采集的樣品帶回實驗室。根據放置樣品所用容器的不同，可將樣品的采集方法分為：厭氧試管法、厭氧罐或厭氧袋法、棉拭子法三種，采集時應視具體情況，選擇其中一種方法。 3.1 厭氧試管法 3.1.1 儀器和用具 3.1.1.1厭氧試管
帶丁基膠塞的可密封的試管、小瓶，或其他容器。可通入無氧氣（O2）的氮氣（N2）、二氧化碳氣體（CO2）、或氮氣、二氧化碳氣體和氫氣的混合氣體（CO2、N2和H2），以置換管內空氣，創造厭氧條件。 3.1.1.無菌注射器。 3.1.2 稀釋液
常用磷酸鹽緩沖液做為稀釋液（NaCl 0.85g，Na2HPO4 0.25g， NaH2PO4 0.56g，蒸餾水 100ml）。 3.1.3 取樣對于土壤、污泥等可大量獲得的樣品，可將樣品直接裝入滅菌的厭氧試管中，直**裝滿，塞上膠塞，擰緊螺口膠蓋。對于從動物腸道、口腔等部位采集的少量樣品，直接將樣品迅速裝入滅菌的、盛有預還原稀釋液的厭氧試管內，立即塞上膠塞，擰緊螺口膠蓋。對于液體樣品應用無菌注射器抽取樣品，取樣后立即排除多余空氣，將樣品注射進滅菌的厭氧試管中。 3.2 厭氧罐或厭氧袋法 3.2.1 儀器和用具 3.2.1.1厭氧罐或厭氧袋
可以密封的容器。利用化學方法，去除容器中的氧氣，創造厭氧環境。 3.2.1.2滅菌的平皿、三角瓶或試管 3.2.2 取樣
將樣品盡快裝入滅菌的平皿、三角瓶或試管等器皿中，然后放入厭氧罐或厭氧袋內。 3.2.3 棉拭子法
采取臨床樣品時常用此法。 3.3.1 儀器和用具 3.3.1.1厭氧試管
同4.1.1.1。 3.3.1.2棉拭子
無菌棉拭子，裝在厭氧試管中。 3.3.1.3半固體瓊脂培養基
去除氧氣的半固體培養基，分裝在厭氧試管中。 3.3.2 取樣
用棉拭子采樣后，直接插入裝有半固體培養基的厭氧試管內。 4 樣品分離
厭氧細菌和古菌樣品的分離，通常采用系列稀釋滾管法或平皿涂布法。對于樣品中含量很少的微生物如光合細菌，應先用富集培養基對其進行富集培養，然后利用選擇性培養基進行分離。 4.1 滾管法 4.1.1 儀器和用具 4.1.1.1 厭氧試管
同3.1.1.1。 4.1.1.2振蕩器
4.1.1.3無菌注射器、彎頭毛細管、乳膠管 4.1.1.4盛有冰塊的托盤或滾管機 4.1.1.5顯微鏡 4.1.2 稀釋液
同4.1.2。 4.1.3 滾管分離 4.1.3.1樣品稀釋
取1g或1mL（混合均勻的液體）樣品，置于裝有9mL或4.5mL預還原稀釋液的厭氧管內,在振蕩器上振蕩均勻，用無菌注射器取1mL或0.5mL樣品稀釋液加**另一裝9mL或4.5mL的稀釋液的試管內。按此操作依次制備成10-1—10-9的樣品稀釋液，備用。 4.1.3.2滾管
將盛有無氧無菌瓊脂培養基的試管加熱**100℃，使瓊脂熔化，并保溫在50℃左右的水浴中，備用。用無菌注射器取**少3個稀釋度的樣品稀釋液0.1-0.2mL，加入盛有溶化的預還原培養基的厭氧試管內，將試管平放于盛有冰塊的盤中或放在特制的滾管機上迅速滾動，培養基在試管內壁立即凝固成一薄層。適溫培養后，在瓊脂層內或表面形成菌落。滾管前**好用顯微鏡觀察待分離的樣品，了解樣品中的細菌或古菌形態類型及其濃度，作為分離樣品的參考。 4.1.3.3分離培養
挑取單菌落時，將形成單菌落的試管和一支盛有無菌、厭氧培養液的試管固定在適當的支架上，去掉試管的膠塞，插入滅菌的注射器針頭，通入氣流速度適當的、無菌的、高純氮氣。將無菌彎頭毛細管小心插入形成單菌落的試管內，輕輕吸取預先作好標記的單菌落，轉移**盛有厭氧培養液的試管內，塞上膠塞，擰緊螺口膠木蓋，適溫培養。形成的菌落需及時進行單菌落的挑取和移植，鏡檢其形態及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋、滾管，并再次挑取單菌落，直**獲得純培養物為止。 #p#分頁標題#e#
分離的單菌落也可在厭氧手套箱內挑取。 4.2 平皿涂布法 4.2.1 儀器和用具
4.2.1.1厭氧罐或厭氧手套箱 4.2.1.2玻璃刮刀 4.2.2 涂布分離
根據5.1.3.1中所述方法對樣品進行稀釋，于厭氧手套箱中，取一定稀釋度的樣品稀釋液0.2-0.5mL置于瓊脂平板上，用玻璃刮刀涂抹均勻，置于厭氧罐或厭氧手套箱中，適溫培養。待形成菌落后，及時在厭氧環境中進行單菌落的挑取和移植。
5 分離菌種的培養
分離得到的厭氧細菌或古菌，應接種在適宜其生長的厭氧培養基中，置于厭氧環境中，適溫培養。 5.1 儀器和用具 5.1.1 厭氧試管
同4.1.1.1。
5.1.2 厭氧手套箱、厭氧罐，或厭氧袋 5.1.3 細口圓底燒瓶 5.2 厭氧培養基的制備 5.2.1 制備
采用煮沸法去除培養基中的氧氣。將盛有已熔化的培養基（已加入氧化還原電位指示劑—刃天青（Resazurin））的細口圓底燒瓶，在酒精燈上加熱，煮沸培養基，同時通入純度為99.99%的高純氮氣，氧氣已被完全去除后，培養基從紅色變為無色，此時加入規定用量的半胱氨酸。 5.2.2 分裝制備厭氧培養基的同時，將純度為99.99%的高純氮氣通入空的試管中。去除試管中的氧氣。將上述無氧培養基分裝進厭氧試管中，塞上膠塞，擰緊膠木蓋，滅菌備用。
5.3 厭氧細菌和古菌的培養
將分離得到的厭氧細菌或古菌接種在適宜的厭氧培養基中，直接在厭氧試管中進行培養，或者在可獲得厭氧環境的裝置中進行培養，如厭氧手套箱、厭氧罐或厭氧袋等。
參考文獻
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厭氧微生物的分離與培養
一、實驗目的
熟練掌握Hungate厭氧操作技能，了解和掌握厭氧微生物的培養基配制，并進行分離純化。 二、實驗用具
裝有分壓表的氮氣鋼瓶，氫氣鋼瓶，調壓變壓器，銅柱和銅柱固定架，高壓滅菌鍋，厭氧管（15ml）,厭氧瓶(50ml)，異丁烯橡膠塞、電爐、圓底燒瓶（500ml、1000ml）、各種規格的定量注射器（1ml、2ml，5ml），18#針頭，酒精燈，酒精棉等。 三、實驗操作
(一)、高純無氧N2的制備
1、 接通電源：把輸出電壓緩緩從0伏分級升到50～90伏之間（調電壓的過程持續大約2-3s
就可以了）。大約20分鐘后，銅柱溫度能達到350℃左右（輸出電壓禁止長時間超過90V以上，否則會導致銅玻璃柱變形直**破裂，甚**發生安全事故）。
2、 待銅柱溫度升**350℃左右時，加熱套觸摸起來比較燙，開啟氫氣鋼瓶并形成氣流，使銅
柱內的銅絲還原（反應速率很快，幾秒鐘見效，還原與否可以從銅絲顏色的變化看到，同時柱內會產生水蒸氣，氧化銅與氫氣反應所致；通氫氣的時候**好打開窗戶，一定熄滅操作臺邊上所有明火，包括酒精燈和電爐）。
3、 待銅絲被氫氣還原呈現純紫銅錚亮色，同時把里面的水蒸氣也排出完全后，關閉氫氣鋼瓶，
壓力表指針降為零；打開氮氣鋼瓶，氣流大小以把針頭對準操作者手背5cm距離明顯感覺到氣流為宜，并隨時注意氣流是否足夠。
4、 使用完畢后，先關緊氮氣鋼瓶，使壓力表的指示針回**零位，接著關閉電源，使調壓變壓
器調節指示回**0伏處。 (二)、無氧無菌水的配制
1. 將500ml一定濃度的NaCl水溶液（防止稀釋時細胞漲破）沿玻璃棒倒入固定在鐵架臺
上的1000ml圓底燒瓶中（選擇合適的圓底燒瓶，水不可太滿，否則水沸騰時容易濺出），**好放入幾個防爆玻璃珠。向500ml水中加入終濃度為0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5ml 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(終濃度0.5‰)。在燒瓶外壁溶液水平面處劃一刻度后，加入適量水（因為蒸發會損失部分水分）。煮沸5-10min（視所加水總量而定），刃天青會根據水中含氧量的下降經歷紫色-紅色-無色的顏色變化，當溶液變為無色后，再煮沸5min，然后通高純氮氣1-2min（趕走空氣）。
2. 分裝的過程可以不用繼續加熱，用10ml的定量注射針筒抽進氮氣流，再打出（三次以
上）洗氣，然后抽取9ml無氧水注入已換氣的15ml厭氧管中（抽取注射過程中應迅速利落，與空氣接觸時間應縮****短）；注入厭氧管后，需要等待通氣5s-10s，以置換瓶中空氣，在抽出氮氣流針頭的同時塞緊異丁烯橡膠塞（操作要*：抽出針頭時要注意，橡膠塞應該先半扣到瓶口，然后用右手食指撳住，左手捏住通氣針頭慢慢抽出針頭，橡膠塞可能會外翻導致漏氣等，此時將針頭往瓶內伸，使塞子恢復原樣，有時需要反復多次，視塞子大小而定，**后拔出針頭，拔出同時立即將塞子塞進管口），**后旋緊蓋子。 3. 121℃高壓蒸汽滅菌20min。 #p#分頁標題#e#
（三）、專性厭氧菌液體培養基配制（以制備1000ml為例）
1、 按照配方配制培養基，定容后，加入1ml的1‰刃天青母液（W/V）(終濃度0.001‰)，0.4g
的半胱氨酸（L-Cysteine）(終濃度0.4‰)，用NaOH或KOH調節pH值（resazurin和半胱氨酸對培養基的pH有影響，應加入后再測pH）。
2、 制備高純氮氣，操作過程同（一）；將厭氧管固定到鐵架臺的夾子上并通氮氣，在培養基
中加入5% Na2S•9H2O溶液，使其終濃度為0.5‰，用槍吸取適量培養基注入到厭氧管（或厭氧瓶中），通氣10-20S，塞上橡膠塞，旋緊蓋子。
3、 厭氧試管用牛皮筋扎成7支或者10支一捆即可滅菌，121℃濕熱滅菌20min。 （四）厭氧菌固體培養基配制 1、 同（三）1。
2、 取上述培養基注入母液圓底燒瓶中（可以預先在圓底燒瓶外壁用記號筆劃上體積刻度），再
加瓊脂粉和適量蒸餾水以彌補在煮沸過程中蒸發的損失量。然后煮沸15-20mins，驅除培養基中的溶解氧。(應特別注意：融化的固體培養基在沸騰時容易從燒瓶瓶口溢出引起電爐短路，從而將電爐燒壞)，在接近沸騰時要把電爐移開。
3、 煮沸10分鐘后，開始通高純氮氣；將厭氧管固定到鐵架臺的夾子上并通氮氣，加入5%
Na2S•9H2O溶液，使其終濃度為0.5‰。然后用10ml的定量注射針筒取5ml培養基注入15ml已換氣的厭氧試管中。（注意：因為是固體培養基，注射器活塞處容易被瓊脂粘住，使得封閉性較高，相對來說不易變紅，但是也會有少許顏色，不用擔心，同樣加入少量硫化鈉到管子或者瓶子內即可）。
4、 滅菌后的培養基取出來，就進行滾管操作。使滅完菌還未冷卻的固體培養基在桌面勻速滾動，
培養基會均勻固定在厭氧管壁上；也可以做成斜面狀，但是如果是分菌的話應該是滾管更加好點，因為接觸面積大。**后，管底會留有稍許的冷凝水。
5、 注：如果是制備少量固體培養基，也可先在厭氧管中加入終濃度為2%的瓊脂后按液體培養
基的配制方法配制。滅好菌后，把瓊脂搖勻后滾管或擺斜面。 （五）厭氧菌分離純化
1、富集培養：用滅菌小鐵鍬鏟取0.5g-2.5g樣品**裝有20-25ml培養基的厭氧瓶內，充N2 ，塞
緊塞子，然后振蕩均勻，一定溫度下靜置培養。培養幾天后進行稀釋涂布，方法在“直接涂布法”中有詳細介紹。 2、直接涂布法：
1）樣品梯度稀釋：取含9ml無氧無菌水的厭氧試管若干支，用無菌1ml定量注射器以10倍稀
釋法稀釋污泥菌懸液**合適濃度（稀釋度視樣品生長情況而定, 要注意用1ml注射器與18#針頭結合時，1ml注射器的量程已經不準確，經過移液槍的確定，0.7ml刻度處即相當于1ml）。由于沒有經過富集所以樣品中含有的菌量較少，直接涂布法中菌懸液的稀釋度做到10-2就可以了；而富集后的菌液為得到單菌落，稀釋度一般要做到10-6。
2）涂布：用無菌1ml定量注射器取相應稀釋度的污泥菌懸液0.2ml于含4.5ml的固體培養基的
厭氧試管中，立即滾管。滾管的要*是：注射器從梯度稀釋液轉移到滾管之內后，塞緊塞子，將稀釋液均勻涂滾于厭氧管壁內，然后再取出塞子，通無氧高氮氣體，用無菌注射器與無菌針頭將多余的液體（包括了原來的冷凝水與稀釋液）吸出來，可防止過多的水滯留導致滾管模糊、菌落不清。
3）培養：培養溫度以及培養時間看菌的生長來定，有些只要兩三天，長的需要十來天，這些可
以查其他科技工作者所做的相關屬菌株的條件來設定，一般如果條件合適，3天左右會有菌落長出。
（六）厭氧菌菌落的觀察和純化
1、觀察 4d培養后，觀察厭氧試管內壁上出現菌落；
2、純化 多次涂布滾管，挑單菌落純化，若在低稀釋度下形成了單克隆菌落，那么可以認為其
已經比較純，也可以做鑒定工作，比如簡單染色觀察菌落形態是否一致等。
建議：
1. 將刃天青配成母液，母液濃度為1‰（W/V），4℃冰箱放置。
2、專性厭氧菌生長于很低的氧化還原電勢下，其呼吸鏈末端電子受體為無機氧化物和有機氧化物的生物氧化，這是一類在無氧或低氧條件下進行的產能效率較低的呼吸形式。 3、刃天青的指示：刃天青在氧化態時呈紫絳色，在完全還原時為無色，它**步不可逆地還原為Resorufin, 呈現桃紅色，然后再可逆性地還原為無色的二氫Resorufin。如果制備的培養基呈現桃紅色，表明培養基已經被氧化，氧還電位已升高。其還原指示電位為-42mv。
