对于厌氧细菌和古菌，在进行取样、分离和培养的各个环节均必须注重这类微生物的特性，采用相适应的方法，使采集的样品具有代表性，尽可能保持其在原生境的种类和数量，并通过分离和培养将其反映和显示出来，同时取得所需的试验菌种。
本规程规定了厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养的方法和要求。 厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养技术规程 1 范围
本规程规定了厌氧细菌和古菌样品采集的要求及根据样品量的大小所应采取的采样方法；规定了厌氧细菌、古菌样品分离和培养的具体方法。
本规程适用于不同生境中厌氧细菌和古菌样品的采集；以及各类厌氧细菌和古菌的分离培养。 2 术语和定义
本规范采用下列术语和定义。2.1 厌氧细菌和古菌 Anaerobic Bacteria and Archaea
厌氧细菌和古菌如梭菌属（Clostridium）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）等，是指要求在没有分子氧条件下才能生活的各种细菌和古菌。本文所指厌氧细菌和古菌为专性厌氧细菌和古菌， 2.2 Hungate厌氧技术 Hungate method
Hungate厌氧技术是美G微生物学家Hungate于1950年**的一套有效的用于厌氧菌分离和培养的技术，它包括培养基预还原和在无氧环境中进行的菌株分离和培养操作技术。利用该技术，许多严格厌氧细菌和古菌的分离、培养获得了成功。
2.3 厌氧手套箱 Anaerobic chamber (glove box)
厌氧手套箱利用预置在箱内的钯催化剂，催化氢气与氧结合生成水，从而达到除去箱内氧气的目的。它包括操作室和交换室两部分。操作室用于厌氧分离、培养，交换室用于操作室内外物品的传递。 3 样品采集
采集厌氧细菌和古菌样品时，应尽可能避免将样品较长时间暴露于空气中,尽快将采集的样品带回实验室。根据放置样品所用容器的不同，可将样品的采集方法分为：厌氧试管法、厌氧罐或厌氧袋法、棉拭子法三种，采集时应视具体情况，选择其中一种方法。 3.1 厌氧试管法 3.1.1 仪器和用具 3.1.1.1厌氧试管
带丁基胶塞的可密封的试管、小瓶，或其他容器。可通入无氧气（O2）的氮气（N2）、二氧化碳气体（CO2）、或氮气、二氧化碳气体和氢气的混合气体（CO2、N2和H2），以置换管内空气，创造厌氧条件。 3.1.1.无菌注射器。 3.1.2 稀释液
常用磷酸盐缓冲液做为稀释液（NaCl 0.85g，Na2HPO4 0.25g， NaH2PO4 0.56g，蒸馏水 100ml）。 3.1.3 取样对于土壤、污泥等可大量获得的样品，可将样品直接装入灭菌的厌氧试管中，直**装满，塞上胶塞，拧紧螺口胶盖。对于从动物肠道、口腔等部位采集的少量样品，直接将样品迅速装入灭菌的、盛有预还原稀释液的厌氧试管内，立即塞上胶塞，拧紧螺口胶盖。对于液体样品应用无菌注射器抽取样品，取样后立即排除多余空气，将样品注射进灭菌的厌氧试管中。 3.2 厌氧罐或厌氧袋法 3.2.1 仪器和用具 3.2.1.1厌氧罐或厌氧袋
可以密封的容器。利用化学方法，去除容器中的氧气，创造厌氧环境。 3.2.1.2灭菌的平皿、三角瓶或试管 3.2.2 取样
将样品尽快装入灭菌的平皿、三角瓶或试管等器皿中，然后放入厌氧罐或厌氧袋内。 3.2.3 棉拭子法
采取临床样品时常用此法。 3.3.1 仪器和用具 3.3.1.1厌氧试管
同4.1.1.1。 3.3.1.2棉拭子
无菌棉拭子，装在厌氧试管中。 3.3.1.3半固体琼脂培养基
去除氧气的半固体培养基，分装在厌氧试管中。 3.3.2 取样
用棉拭子采样后，直接插入装有半固体培养基的厌氧试管内。 4 样品分离
厌氧细菌和古菌样品的分离，通常采用系列稀释滚管法或平皿涂布法。对于样品中含量很少的微生物如光合细菌，应先用富集培养基对其进行富集培养，然后利用选择性培养基进行分离。 4.1 滚管法 4.1.1 仪器和用具 4.1.1.1 厌氧试管
同3.1.1.1。 4.1.1.2振荡器
4.1.1.3无菌注射器、弯头毛细管、乳胶管 4.1.1.4盛有冰块的托盘或滚管机 4.1.1.5显微镜 4.1.2 稀释液
同4.1.2。 4.1.3 滚管分离 4.1.3.1样品稀释
取1g或1mL（混合均匀的液体）样品，置于装有9mL或4.5mL预还原稀释液的厌氧管内,在振荡器上振荡均匀，用无菌注射器取1mL或0.5mL样品稀释液加**另一装9mL或4.5mL的稀释液的试管内。按此操作依次制备成10-1—10-9的样品稀释液，备用。 4.1.3.2滚管
将盛有无氧无菌琼脂培养基的试管加热**100℃，使琼脂熔化，并保温在50℃左右的水浴中，备用。用无菌注射器取**少3个稀释度的样品稀释液0.1-0.2mL，加入盛有溶化的预还原培养基的厌氧试管内，将试管平放于盛有冰块的盘中或放在特制的滚管机上迅速滚动，培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。适温培养后，在琼脂层内或表面形成菌落。滚管前**好用显微镜观察待分离的样品，了解样品中的细菌或古菌形态类型及其浓度，作为分离样品的参考。 4.1.3.3分离培养
挑取单菌落时，将形成单菌落的试管和一支盛有无菌、厌氧培养液的试管固定在适当的支架上，去掉试管的胶塞，插入灭菌的注射器针头，通入气流速度适当的、无菌的、高纯氮气。将无菌弯头毛细管小心插入形成单菌落的试管内，轻轻吸取预先作好标记的单菌落，转移**盛有厌氧培养液的试管内，塞上胶塞，拧紧螺口胶木盖，适温培养。形成的菌落需及时进行单菌落的挑取和移植，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释、滚管，并再次挑取单菌落，直**获得纯培养物为止。 #p#分页标题#e#
分离的单菌落也可在厌氧手套箱内挑取。 4.2 平皿涂布法 4.2.1 仪器和用具
4.2.1.1厌氧罐或厌氧手套箱 4.2.1.2玻璃刮刀 4.2.2 涂布分离
根据5.1.3.1中所述方法对样品进行稀释，于厌氧手套箱中，取一定稀释度的样品稀释液0.2-0.5mL置于琼脂平板上，用玻璃刮刀涂抹均匀，置于厌氧罐或厌氧手套箱中，适温培养。待形成菌落后，及时在厌氧环境中进行单菌落的挑取和移植。
5 分离菌种的培养
分离得到的厌氧细菌或古菌，应接种在适宜其生长的厌氧培养基中，置于厌氧环境中，适温培养。 5.1 仪器和用具 5.1.1 厌氧试管
同4.1.1.1。
5.1.2 厌氧手套箱、厌氧罐，或厌氧袋 5.1.3 细口圆底烧瓶 5.2 厌氧培养基的制备 5.2.1 制备
采用煮沸法去除培养基中的氧气。将盛有已熔化的培养基（已加入氧化还原电位指示剂—刃天青（Resazurin））的细口圆底烧瓶，在酒精灯上加热，煮沸培养基，同时通入纯度为99.99%的高纯氮气，氧气已被完全去除后，培养基从红色变为无色，此时加入规定用量的半胱氨酸。 5.2.2 分装制备厌氧培养基的同时，将纯度为99.99%的高纯氮气通入空的试管中。去除试管中的氧气。将上述无氧培养基分装进厌氧试管中，塞上胶塞，拧紧胶木盖，灭菌备用。
5.3 厌氧细菌和古菌的培养
将分离得到的厌氧细菌或古菌接种在适宜的厌氧培养基中，直接在厌氧试管中进行培养，或者在可获得厌氧环境的装置中进行培养，如厌氧手套箱、厌氧罐或厌氧袋等。
参考文献
[1] 凌代文, 东秀珠. 1999. 乳酸细菌分类鉴定及试验方法. 北京：中G轻工业出版社. 1-176
[2] **祖农等. 1990. 微生物学词典. 北京: 科学出版社
[3] Sutter, V.L.,Citron, D.M.et al. 1980. Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual, 3rd ed. C.V.Mosby Company.
[4] Holdeman, L.V., Cato, E. P. & Moore, W. E. C. (1977). Anaerobe Laboratory Manual, 4th edn. Blacksburg, VA: Virginia Polytechnic Institute and State University.
厌氧微生物的分离与培养
一、实验目的
熟练掌握Hungate厌氧操作技能，了解和掌握厌氧微生物的培养基配制，并进行分离纯化。 二、实验用具
装有分压表的氮气钢瓶，氢气钢瓶，调压变压器，铜柱和铜柱固定架，高压灭菌锅，厌氧管（15ml）,厌氧瓶(50ml)，异丁烯橡胶塞、电炉、圆底烧瓶（500ml、1000ml）、各种规格的定量注射器（1ml、2ml，5ml），18#针头，酒精灯，酒精棉等。 三、实验操作
(一)、高纯无氧N2的制备
1、 接通电源：把输出电压缓缓从0伏分级升到50～90伏之间（调电压的过程持续大约2-3s
就可以了）。大约20分钟后，铜柱温度能达到350℃左右（输出电压禁止长时间超过90V以上，否则会导致铜玻璃柱变形直**破裂，甚**发生安全事故）。
2、 待铜柱温度升**350℃左右时，加热套触摸起来比较烫，开启氢气钢瓶并形成气流，使铜
柱内的铜丝还原（反应速率很快，几秒钟见效，还原与否可以从铜丝颜色的变化看到，同时柱内会产生水蒸气，氧化铜与氢气反应所致；通氢气的时候**好打开窗户，一定熄灭操作台边上所有明火，包括酒精灯和电炉）。
3、 待铜丝被氢气还原呈现纯紫铜铮亮色，同时把里面的水蒸气也排出完全后，关闭氢气钢瓶，
压力表指针降为零；打开氮气钢瓶，气流大小以把针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意气流是否足够。
4、 使用完毕后，先关紧氮气钢瓶，使压力表的指示针回**零位，接着关闭电源，使调压变压
器调节指示回**0伏处。 (二)、无氧无菌水的配制
1. 将500ml一定浓度的NaCl水溶液（防止稀释时细胞涨破）沿玻璃棒倒入固定在铁架台
上的1000ml圆底烧瓶中（选择合适的圆底烧瓶，水不可太满，否则水沸腾时容易溅出），**好放入几个防爆玻璃珠。向500ml水中加入终浓度为0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5ml 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(终浓度0.5‰)。在烧瓶外壁溶液水平面处划一刻度后，加入适量水（因为蒸发会损失部分水分）。煮沸5-10min（视所加水总量而定），刃天青会根据水中含氧量的下降经历紫色-红色-无色的颜色变化，当溶液变为无色后，再煮沸5min，然后通高纯氮气1-2min（赶走空气）。
2. 分装的过程可以不用继续加热，用10ml的定量注射针筒抽进氮气流，再打出（三次以
上）洗气，然后抽取9ml无氧水注入已换气的15ml厌氧管中（抽取注射过程中应迅速利落，与空气接触时间应缩****短）；注入厌氧管后，需要等待通气5s-10s，以置换瓶中空气，在抽出氮气流针头的同时塞紧异丁烯橡胶塞（操作要*：抽出针头时要注意，橡胶塞应该先半扣到瓶口，然后用右手食指揿住，左手捏住通气针头慢慢抽出针头，橡胶塞可能会外翻导致漏气等，此时将针头往瓶内伸，使塞子恢复原样，有时需要反复多次，视塞子大小而定，**后拔出针头，拔出同时立即将塞子塞进管口），**后旋紧盖子。 3. 121℃高压蒸汽灭菌20min。 #p#分页标题#e#
（三）、专性厌氧菌液体培养基配制（以制备1000ml为例）
1、 按照配方配制培养基，定容后，加入1ml的1‰刃天青母液（W/V）(终浓度0.001‰)，0.4g
的半胱氨酸（L-Cysteine）(终浓度0.4‰)，用NaOH或KOH调节pH值（resazurin和半胱氨酸对培养基的pH有影响，应加入后再测pH）。
2、 制备高纯氮气，操作过程同（一）；将厌氧管固定到铁架台的夹子上并通氮气，在培养基
中加入5% Na2S•9H2O溶液，使其终浓度为0.5‰，用枪吸取适量培养基注入到厌氧管（或厌氧瓶中），通气10-20S，塞上橡胶塞，旋紧盖子。
3、 厌氧试管用牛皮筋扎成7支或者10支一捆即可灭菌，121℃湿热灭菌20min。 （四）厌氧菌固体培养基配制 1、 同（三）1。
2、 取上述培养基注入母液圆底烧瓶中（可以预先在圆底烧瓶外壁用记号笔划上体积刻度），再
加琼脂粉和适量蒸馏水以弥补在煮沸过程中蒸发的损失量。然后煮沸15-20mins，驱除培养基中的溶解氧。(应特别注意：融化的固体培养基在沸腾时容易从烧瓶瓶口溢出引起电炉短路，从而将电炉烧坏)，在接近沸腾时要把电炉移开。
3、 煮沸10分钟后，开始通高纯氮气；将厌氧管固定到铁架台的夹子上并通氮气，加入5%
Na2S•9H2O溶液，使其终浓度为0.5‰。然后用10ml的定量注射针筒取5ml培养基注入15ml已换气的厌氧试管中。（注意：因为是固体培养基，注射器活塞处容易被琼脂粘住，使得封闭性较高，相对来说不易变红，但是也会有少许颜色，不用担心，同样加入少量硫化钠到管子或者瓶子内即可）。
4、 灭菌后的培养基取出来，就进行滚管操作。使灭完菌还未冷却的固体培养基在桌面匀速滚动，
培养基会均匀固定在厌氧管壁上；也可以做成斜面状，但是如果是分菌的话应该是滚管更加好点，因为接触面积大。**后，管底会留有稍许的冷凝水。
5、 注：如果是制备少量固体培养基，也可先在厌氧管中加入终浓度为2%的琼脂后按液体培养
基的配制方法配制。灭好菌后，把琼脂摇匀后滚管或摆斜面。 （五）厌氧菌分离纯化
1、富集培养：用灭菌小铁锹铲取0.5g-2.5g样品**装有20-25ml培养基的厌氧瓶内，充N2 ，塞
紧塞子，然后振荡均匀，一定温度下静置培养。培养几天后进行稀释涂布，方法在“直接涂布法”中有详细介绍。 2、直接涂布法：
1）样品梯度稀释：取含9ml无氧无菌水的厌氧试管若干支，用无菌1ml定量注射器以10倍稀
释法稀释污泥菌悬液**合适浓度（稀释度视样品生长情况而定, 要注意用1ml注射器与18#针头结合时，1ml注射器的量程已经不准确，经过移液枪的确定，0.7ml刻度处即相当于1ml）。由于没有经过富集所以样品中含有的菌量较少，直接涂布法中菌悬液的稀释度做到10-2就可以了；而富集后的菌液为得到单菌落，稀释度一般要做到10-6。
2）涂布：用无菌1ml定量注射器取相应稀释度的污泥菌悬液0.2ml于含4.5ml的固体培养基的
厌氧试管中，立即滚管。滚管的要*是：注射器从梯度稀释液转移到滚管之内后，塞紧塞子，将稀释液均匀涂滚于厌氧管壁内，然后再取出塞子，通无氧高氮气体，用无菌注射器与无菌针头将多余的液体（包括了原来的冷凝水与稀释液）吸出来，可防止过多的水滞留导致滚管模糊、菌落不清。
3）培养：培养温度以及培养时间看菌的生长来定，有些只要两三天，长的需要十来天，这些可
以查其他科技工作者所做的相关属菌株的条件来设定，一般如果条件合适，3天左右会有菌落长出。
（六）厌氧菌菌落的观察和纯化
1、观察 4d培养后，观察厌氧试管内壁上出现菌落；
2、纯化 多次涂布滚管，挑单菌落纯化，若在低稀释度下形成了单克隆菌落，那么可以认为其
已经比较纯，也可以做鉴定工作，比如简单染色观察菌落形态是否一致等。
建议：
1. 将刃天青配成母液，母液浓度为1‰（W/V），4℃冰箱放置。
2、专性厌氧菌生长于很低的氧化还原电势下，其呼吸链末端电子受体为无机氧化物和有机氧化物的生物氧化，这是一类在无氧或低氧条件下进行的产能效率较低的呼吸形式。 3、刃天青的指示：刃天青在氧化态时呈紫绛色，在完全还原时为无色，它**步不可逆地还原为Resorufin, 呈现桃红色，然后再可逆性地还原为无色的二氢Resorufin。如果制备的培养基呈现桃红色，表明培养基已经被氧化，氧还电位已升高。其还原指示电位为-42mv。
