厭氧菌是自然界中分布廣泛、性能獨(dú)特的一類微生物, 專性厭氧菌因其細(xì)胞內(nèi)缺乏超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶或過(guò)氧化物酶,因此無(wú)法消除機(jī)體在有氧條件下產(chǎn)生的有毒產(chǎn)物——超氧陰離子自由基，故這類微生物極易受氧毒害。專性厭氧微生物即使短暫地把它暴露于空氣中,也會(huì)引起損傷致死。因此對(duì)它們進(jìn)行分離、培養(yǎng)和研究時(shí),就必須有一套相應(yīng)的培養(yǎng)分離方法。 目的要求
1、了解厭氧菌培養(yǎng)常用方法：皰肉培養(yǎng)法、焦性沒(méi)食子酸法、厭氧罐法、厭氧箱法、厭氧培養(yǎng)袋法等。
2、掌握結(jié)核桿菌的形態(tài)特點(diǎn)，熟悉結(jié)核桿菌的培養(yǎng)特性。 3、掌握抗酸染色的原理及操作過(guò)程。
4、了解結(jié)核桿菌標(biāo)本的采集、培養(yǎng)前處理及制片。 材料
皰肉培養(yǎng)基、厭氧罐、厭氧箱、厭氧培養(yǎng)袋、焦性沒(méi)食子酸、NaOH、脫脂棉等 內(nèi)容與方法
厭氧菌培養(yǎng)方法：包括物理、化學(xué)和生物學(xué)方法（總之為厭氧菌培養(yǎng)形成一種無(wú)氧環(huán)境） 1. 厭氧罐法：
厭氧產(chǎn)氣袋加入水后會(huì)產(chǎn)生氫氣和二氧化碳，氫氣在厭氧催化劑（冷觸酶鈀粒鈀粒由粉紅色變成淺蘭色而失效，160℃2h，即可恢復(fù)其活力而重復(fù)使用）的作用下，與氧結(jié)合生成水，可在30分鐘內(nèi)將氧含量降**1%以下。二氧化碳可以促進(jìn)厭氧菌的生長(zhǎng)。罐內(nèi)放有煮沸去氧的美蘭指示劑一管。 [每次要新鮮配制，在試管內(nèi)將亞甲藍(lán)(0.5%亞甲藍(lán)3 ml加水**100 ml)、6%葡萄糖和氫氧化鈉(1/10 mol/L NaOH 6 ml加水**100 ml)3種溶液等量混合并煮沸還原**無(wú)色，立即將指示劑管放入預(yù)先裝好培養(yǎng)物的罐內(nèi) 。如果能在孵育的整個(gè)過(guò)程中維持厭氧條件，則指示劑溶液將無(wú)色，否則指示劑則變色。亞甲藍(lán)有氧為藍(lán)色，無(wú)氧為無(wú)色。] 亞甲藍(lán)作為一種氧化還原指示劑。 2.焦性沒(méi)食子酸法：
焦性沒(méi)食子酸+NaOH→焦性沒(méi)食子橙（黑、褐色）[吸收游離的氧氣]。 培養(yǎng)皿法用培養(yǎng)皿蓋，鋪上一薄層滅菌脫脂棉，將1g焦性沒(méi)食子酸放于其上。用肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半劃線接種巴氏芽孢梭菌，下一半劃線接種熒光假單胞菌，并在皿底用記號(hào)筆作好標(biāo)記。滴加10％NaOH溶液約0.5ml于焦性沒(méi)食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即將已接種的平板覆蓋于玻璃板上或培養(yǎng)皿蓋上，必須將脫脂棉全部罩住，焦性沒(méi)食子酸反應(yīng)物切勿與培養(yǎng)基表面接觸，以溶化的石蠟 密封皿底與玻璃板或皿蓋的接觸處。置37℃溫箱培養(yǎng)24～48h。 3.
厭氧培養(yǎng)箱法：
由厭氧環(huán)境操作箱、恒溫培養(yǎng)箱、高度真空傳遞箱等組成，能任意輸入所需氣體，準(zhǔn)確調(diào)節(jié)流量，以滿足厭氧菌生長(zhǎng)需要。
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原理
分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時(shí)與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色,達(dá)到染色目的。 材料
酒精燈、玻片、結(jié)核病人痰液、石碳酸復(fù)紅、鹽酸酒精、堿性美蘭等 步驟
1.取開(kāi)放性肺結(jié)核病人的痰液涂片，自然干燥后，通過(guò)火焰固定。 2.初染：痰膜上加一小的方形吸水紙，在吸水紙上滴加石炭酸復(fù)紅染液，在火焰高處徐徐加溫**冒蒸氣，并維持 5 分鐘（注意切勿讓染液沸騰或煮干），當(dāng)染液蒸發(fā)減少時(shí)，需再加染液補(bǔ)充。待標(biāo)本片冷卻后水洗。
3.用 3% 鹽酸酒精脫色，**無(wú)紅色染液流下為止（反復(fù)2～3次，一般需要1～2min）水洗。
4.復(fù)染：用堿性美藍(lán)復(fù)染 1 分鐘，水洗，吸干，鏡檢。抗酸桿菌呈紅色，背景及非抗酸菌呈藍(lán)色。
